“小标记”“大变身” - 新升级辣根过氧化物酶（HRP）
发布时间：2024-12-23 点击数：6
一、背景介绍
辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）广泛地分布于植物界，以辣根中含量最高，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉辅基组成的一种糖蛋白，含18%的中性糖和氨基糖，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。HRP由300个氨基酸和4个二硫键连接而成，相对分子质量为40000，等电点为5.5～9.0，最适pH为5～5.5，最适温度40～45℃，易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。它是一种复合酶，是由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。
辣根过氧化物酶的主酶是无色糖蛋白，与酶活性无关，辅基是深棕色的含铁卟啉环，是酶活性基团，酶纯度又称为RZ值，来源于德文Reinheit Zahl。一般将其作为辣根过氧化物酶的纯度指标，含有铁卟啉的蛋白质或酶在400nm附近存在一个非常强的吸收带，辣根过氧化物酶中含有铁卟啉，因此天然的HRP在403nm处有特殊的吸收光谱，而蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸在275nm左右具有强吸收带。所以对于辣根过氧化物酶而言，RZ的定义是同一浓度酶溶液在403nm与275nm两个波长光密度的比值。
RZ值仅仅只能说明血红素基团在辣根过氧化物酶中的含量，并非表示其制剂的真正纯度，而RZ值高的制剂，也并不意味着酶活性高。RZ值与酶活性无关，酶活性是以单位U表示的，即1min将1μmol底物转化为产物所需的酶量。免疫标记中高纯度的酶 RZ 值应在 3.0 左右(最高可达 3.4)。为满足不同领域不同研发需求，西宝生物可提供多种RZ值的酶产品。
依据不同用途，可选用不同类型的商品
产品类型 | 主要应用 |
RZ>3 活性>250u/mg | 主要应用于免疫学上抗体的标记，是高纯度的过氧化酶。采用特殊色谱纯化技术以除去会影响免疫学反应的同工酶B ，可作为酶免类体外诊断试剂盒的开发原料。 |
RZ>2 活性>180u/mg | 主要应用于临床生化，例如总胆固醇检测（TC）、HDL-C、LDL-C、甘油三酯（TG）检测等，亦可用于实验初期蛋白质、抗体等标记。 |
RZ>1 活性>100u/mg | 主要应用于生化领域血糖试纸和尿液分析试纸。 |
因此，在选择HRP时应同时考虑酶活力和RZ这两个数据，可以先考虑酶活性，其次是RZ值。，两者配合选择适合的酶产品。
IVD领域随着ELISA及酶促化学发光检测技术的发展，酶偶联抗体及其偶联方法受到广泛关注。目前常用的偶联方法有过碘酸钠氧化法、碳二亚胺法和SMCC异性双功能偶联法等。《BIOCONJUGATE TECHNIQUES》中介绍了NaIO4 法标记HRP的原理（如图1）。
HRP标记抗体的主要方法是过碘酸钠法。这种方法的基本原理是将HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，然后这个醛基与抗体的氨基（-NH2）反应，形成希夫氏碱（Schiff base）。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白的氨基发生偶合，通常会在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应结束后，再用氰基硼氢化钠或硼氢化钠来稳定希夫氏碱。
图1 HRP标记抗体原理图
西宝生物专为工业生产开发新升级HRP（ECE0066Z）产品，本次我们全新升级后的产品性能稳定可靠，在各种复杂的使用环境中都能始终保持优异的表现。高活性的特点为生化、免疫诊断试剂产品的开发注入了强大动力；单批次产量稳定，这意味着无论您是小规模的研发需求，还是生产的大规格使用，都能得到充分满足；它的适应性极强，适合不同的应用场景，无论是实验室研发，还是大规模生产，都能精准助力，成为您的得力助手。
Seebio 辣根过氧化物酶的特点：
•纯化形式--冻干无盐粉末；即用型溶解和使用
•比活性高--通常大于 270 U/mg（具体酶活可参考COA）
•批间稳定--严格品控，极小批间差异
Seebio新升级辣根过氧化物酶（HRP）产品详情
产品编码 | ECE0066Z |
产品名称 | Peroxidase |
CAS号 | 9003-99-0 |
生物来源 | Horseradish |
RZ值 | ≥3.0 |
比活 | ≥270 U/mg |
分子量 | ~44kDa |
外观 | Red-brown lyophilizate，salt-free |
储存 | -20℃，避光防潮密闭干燥 |
Seebio新升级辣根过氧化物酶（HRP）实用案列介绍
表1 HRP酶参数
参数 | 进口R品牌*HRP酶 | 进口M品牌*HRP酶 | 西宝HRP酶 |
RZ | / | / | ≥3.0 |
活性(U/mg) | 100KU/384mg | / | ≥270.0u/mg |
外观 | 棕色 | 棕色 | 红棕色冻干粉 |
二、性能对比（IVD项目采用高碘酸钠法标记）
2.1标记抗体测试酶活（NaIO4 法）-双抗体夹心法体外诊断项目
2.1.1实验步骤
a）HCG抗体1（货号:EKY0361A）包被；
b）进口R品牌、进口M品牌、西宝HRP酶分别标记HCG抗体2（货号:EKY0360A）（NaIO4法）；
c）配置6个浓度HCG阳性尿液梯度及空白；
d）加样，每个浓度2次重复，孵育及洗涤；
e）在洗涤完成的加入底物，在酶标仪上测试OD值。
2.1.2实验结果
表2 西宝HRP（ECE0066Z）三批次与进口R品牌HRP酶比对（夹心法）
HCG阳性梯度 | 进口R品牌HRP OD值 | 西宝HRP批次 OD值 | 西宝HRP批次2 OD值 | 西宝HRP批次3 OD值 | 西宝HRP批次1与进口R品牌偏差 | 西宝HRP批次2与进口R品牌偏差 | 西宝HRP批次3进口与R品牌偏差 |
原液 | 2.904 | 2.750 | 2.838 | 2.891 | -5.3% | -2.3% | -0.4% |
稀释2倍 | 1.368 | 1.264 | 1.392 | 1.276 | -7.6% | 1.8% | -6.7% |
稀释4倍 | 0.678 | 0.680 | 0.693 | 0.669 | 0.3% | 2.2% | -1.3% |
稀释8倍 | 0.479 | 0.450 | 0.450 | 0.464 | -6.2% | -6.2% | -3.3% |
稀释16倍 | 0.219 | 0.232 | 0.222 | 0.215 | 5.9% | 1.1% | -1.9% |
稀释32倍 | 0.154 | 0.166 | 0.142 | 0.144 | 8.1% | -7.9% | -6.4% |
空白 | 0.081 | 0.083 | 0.077 | 0.079 | 1.6% | -5.3% | -2.5% |
平均偏差 | -0.5% | -2.4% | -3.2% | ||||
由表2实验数据可知，西宝生物三批次HRP酶标记抗体与进口R品牌HRP酶标记抗体测试HCG项目（双抗体夹心法）OD均值偏差分别为-0.5%、-2.4%、-3.2%。表明西宝生物三批次HRP酶批间差异小，与进口R品牌的HRP性能相当，可实现直接升级替换。
表3 西宝HRP（ECE0066Z）三批次与进口M品牌HRP酶比对（夹心法）
HCG阳性梯度 | 进口M品牌HRP OD值 | 西宝HRP批次1 OD值 | 西宝HRP批次2 OD值 | 西宝HRP批次3 OD值 | 西宝HRP批次1与进口M品牌偏差 | 西宝HRP批次2与进口M品牌偏差 | 西宝HRP批次3与进口M品牌偏差 |
原液 | 2.879 | 2.750 | 2.838 | 2.891 | -4.5% | -1.4% | 0.4% |
稀释2倍 | 1.397 | 1.264 | 1.392 | 1.276 | -9.5% | -0.4% | -8.7% |
稀释4倍 | 0.729 | 0.680 | 0.693 | 0.669 | -6.7% | -5.0% | -8.3% |
稀释8倍 | 0.477 | 0.450 | 0.450 | 0.464 | -5.7% | -5.7% | -2.7% |
稀释16倍 | 0.227 | 0.232 | 0.222 | 0.215 | 2.6% | -2.1% | -4.9% |
稀释32倍 | 0.156 | 0.166 | 0.142 | 0.144 | 6.7% | -9.0% | -7.6% |
空白 | 0.081 | 0.083 | 0.077 | 0.079 | 1.8% | -5.1% | -2.3% |
平均偏差 | -2.2% | -4.1% | -4.9% | ||||
由表3实验数据可知，西宝生物三批次HRP酶标记抗体与进口M品牌HRP酶标记抗体测试HCG项目（双抗体夹心法）OD均值偏差分别为-2.2%、-4.1%、-4.9%。表明西宝生物三批次HRP酶批间差异小，与进口M品牌的HRP性能相当，可实现直接升级替换。
2.2标记抗体测试酶活（NaIO4 法）-竞争法法项目
2.2.1实验步骤
a）兔IgG（货号:EKN0347A）包被；
b）进口R品牌、进口M品牌、西宝HRP酶分别标记羊抗兔抗体（货号:ECY4491C）（NaIO4 法）；
c）配置7个浓度羊抗兔抗体梯度及空白；
d）加样，每个浓度2次重复，孵育及洗涤；
e）在洗涤完成的加入底物，在酶标仪上测试OD值。
2.2.2实验结果
表4 西宝三批次HRP与进口R品牌HRP酶比对（竞争法）
浓度 | 进口R品牌HRP OD值 | 西宝HRP批次1 OD值 | 西宝HRP批次2 OD值 | 西宝HRP批次3 OD值 | 西宝HRP批次1与进口R品牌偏差 | 西宝HRP批次2与进口R品牌偏差 | 西宝HRP批次3与进口R品牌偏差 |
原液 | 0.383 | 0.407 | 0.394 | 0.429 | 6.4% | 3.0% | 12.1% |
稀释2倍 | 0.458 | 0.479 | 0.443 | 0.431 | 4.5% | -3.2% | -5.9% |
稀释4倍 | 0.578 | 0.625 | 0.577 | 0.594 | 8.1% | -0.2% | 2.7% |
稀释8倍 | 0.869 | 0.833 | 0.846 | 0.834 | -4.0% | -2.6% | -4.0% |
稀释16倍 | 1.229 | 1.195 | 1.139 | 1.108 | -2.7% | -7.3% | -9.8% |
稀释48倍 | 1.890 | 1.913 | 1.879 | 1.846 | 1.2% | -0.6% | -2.3% |
稀释192倍 | 2.691 | 2.926 | 2.799 | 2.748 | 8.8% | 4.0% | 2.1% |
空白 | 3.655 | 3.710 | 3.700 | 3.656 | 1.5% | 1.2% | 0.0% |
平均偏差 | 3.0% | -0.7% | -0.6% | ||||
由表4实验数据可知，西宝生物三批次HRP酶标记抗体与进口品牌HRP酶标记抗体测试竞争法项目OD均值偏差分别为3.0%、-0.7%、-0.6%。表明西宝生物三批次HRP酶批间差异小，与进口R品牌的HRP性能相当，可实现直接升级替换。
表5 西宝三批次HRP与进口M品牌HRP酶比对（竞争法）
浓度 | 进口M品牌HRP OD值 | 西宝HRP批次1 OD值 | 西宝HRP批次2 OD值 | 西宝HRP批次3 OD值 | 西宝HRP批次1与进口M品牌偏差 | 西宝HRP批次2与进口M品牌偏差 | 西宝HRP批次3与进口M品牌偏差 |
原液 | 0.392 | 0.407 | 0.394 | 0.429 | 3.7% | 0.4% | 9.3% |
稀释2倍 | 0.434 | 0.479 | 0.443 | 0.431 | 10.4% | 2.2% | -0.6% |
稀释4倍 | 0.557 | 0.625 | 0.577 | 0.594 | 12.3% | 3.7% | 6.7% |
稀释8倍 | 0.830 | 0.833 | 0.846 | 0.834 | 0.4% | 2.0% | 0.5% |
稀释16倍 | 1.174 | 1.195 | 1.139 | 1.108 | 1.8% | -3.0% | -5.6% |
稀释48倍 | 1.810 | 1.913 | 1.879 | 1.846 | 5.7% | 3.8% | 2.0% |
稀释192倍 | 2.828 | 2.926 | 2.799 | 2.748 | 3.5% | -1.1% | -2.8% |
空白 | 3.675 | 3.710 | 3.700 | 3.656 | 0.9% | 0.7% | -0.5% |
平均偏差 | 4.8% | 1.1% | 1.1% | ||||
由表5实验数据可知，西宝生物三批次HRP酶标记抗体与进口品牌HRP酶标记抗体测试竞争法项目OD均值偏差分别为4.8%、1.1%、1.1%。表明西宝生物三批次HRP酶批间差异小，与进口M品牌的HRP性能相当，可实现直接升级替换。
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名称 | 货号 | 规格 |
辣根过氧化物酶，270U/mg,RZ≥3.0 | ECE0066Z | 100mg，500mg |
辣根过氧化物酶，290-330U/mg，RZ≥3.0 | ECE0066M | 10mg，100mg，500mg |
Seebio® 碱性磷酸酶(ALP)高活性 | DCE0108L | 5mg，25mg，100mg |
碱性磷酸酶(ALP) | DCE0108K | 5mg，25mg，100mg |
链霉亲和素（SA）（含半胱氨酸） | ECL0006W | 10mg，100mg |
核心链霉亲和素（CSA）） | ECL0006R | 10mg，100mg |
重组链霉亲和素（RSA） | ECL0006V | 10mg，100mg |
辣根过氧化物酶标记链霉亲和素（SA-HRP） | ECE0696C | 1ml |
β-亚基-人绒毛膜促性腺激素抗体（β-HCG Antibody） | EKY0361A | 1mg，5mg |
α-亚基-人绒毛膜促性腺激素抗体（α-HCG Antibody） | EKY0360A | 1mg，5mg |
Seebio® 兔IgG | EKN0347A | 1mg，10mg，100mg |
山羊抗兔IgG（H+L） | ECY4491A | 5mg |
单组份TMB显色液(高灵敏，ELISA HRP显色用) | DCD0506G | 100ml |
TMB显色终止液(450nm, 不含硫酸) | DCD0529A | 100ml |
