人源化单抗技术：多维度视角下的最新进展

人源化单抗技术是一种将鼠源单克隆抗体（McAb）通过基因工程手段改造为更接近人类抗体的结构，以降低其免疫原性并提高其临床应用价值的技术。这项技术的发展经历了多个阶段，从最初的嵌合抗体到现代的全人源化单抗，技术不断演进和完善。

多种CD20单抗结构（图片来源文献）

人源化单抗技术的主要目的是解决鼠源性单抗在人体应用中可能引发的免疫原性反应，如人抗鼠抗体（HAMA）反应、生物活性降低和半衰期短等问题。为了实现这一目标，科学家们采用了多种方法，包括基因重组表达和转基因小鼠技术等。

 

人源化单抗技术路线（图片来源文献）

转基因小鼠技术在单克隆抗体的制备中也发挥了重要作用。通过将人类免疫球蛋白基因导入小鼠体内，可以生产出全人源化的单克隆抗体，这些抗体由于其序列均来自于人，不会产生人抗鼠抗体反应，因此安全性更高。

转基因小鼠平台在生产人类治疗性单克隆抗体方面已经取得了重要进展。通过将人类免疫球蛋白基因座插入生殖细胞系，转基因小鼠能够表达人类抗体库，从而生产出高亲和力的人类抗体。这些抗体来源于多种转基因小鼠和大鼠，如OmniRat、Omni-Mouse、Kymouse等，这些动物被用于生产完全人类异型抗体，这使得它们成为未来治疗性抗体开发的重要平台。

转基因小鼠技术还涉及使用Y染色体显性遗传载体（YACs）和人类化免疫球蛋白基因，以及在小鼠中表达人类重链和轻链等策略，以提高抗体的多样性和效率。这些策略不仅提高了杂交瘤生产效率，还避免了自身免疫反应的问题。

为了进一步降低免疫原性，研究人员还尝试通过重组技术将小鼠抗体的Fab序列与包含人类Fc区域的模板序列进行剪接，生成具有小鼠和人类抗体特异性的复合抗体。Bruggemann et al. (2015) 和 Osborn et al. (2013) 讨论了在转基因动物中产生人类抗体的方法，包括敲除小鼠的免疫球蛋白基因并替换为人类基因。

噬菌体展示技术在人类单克隆抗体生产中的应用也得到了进一步发展。这项技术通过将抗体基因插入噬菌体基因组中，利用噬菌体作为载体展示抗体片段，从而实现高通量筛选和优化抗体序列。这种方法不仅提高了抗体筛选的效率，还降低了成本。

Qi等人在2021年开发了抗体结合表位映射（AbMap）技术，能够在一次实验中对数百种抗体进行表位映射，提高了抗体工程的效率。Fuhner等人在2019年介绍了噬菌体展示技术在单基因库中表位映射的应用，为抗体工程提供了新的工具。Ibsen和Daugherty通过随机肽库筛选和下一代测序预测抗体结构表位，展示了噬菌体展示技术在抗体工程中的创新应用。

近年来，单个B细胞抗体制备技术成为新一代快速制备单克隆抗体的方法。该技术利用每个B细胞仅能产生一种特异性抗体的特性，通过直接筛选出分泌特异性抗体的B细胞，并对其表达抗体重链和轻链的基因进行克隆和体外表达，从而获得特异性单克隆抗体。相较于传统抗体制备技术，该技术具有快速、高效、产量高等优点，且表达的抗体具有天然构象，不仅可用于病原微生物相关抗原的抗体开发、病毒跨种传播机制等研究，还在抗肿瘤治疗、抗自身免疫病等方面发挥重要作用。

Cheng等人利用SEC-seq技术将分子特征与数千个单人浆细胞的抗体分泌关联起来，为抗体发现开辟了新途径。此外，de Rutte等人开发了可悬挂的水凝胶纳米球，用于大规模并行的单细胞功能分析和分选，这为单细胞研究提供了新的工具。 

通过流式细胞术结合单个B细胞基因扩增技术，使得全人源单克隆抗体的构建和筛选更为容易。这种技术的发展为抗体药物的研发提供了新的思路，并推动了单克隆抗体药物市场的扩展。

流式细胞术被广泛用于从血浆中分离和筛选B细胞。通过使用BD FACS AriaII细胞分选器，可以对B细胞进行洗涤、稀释和过滤，去除聚集的细胞，并进一步门选活细胞和特定表面标志物表达的B细胞，如CD19+CD10-CD20+等。在流式细胞术的基础上，可以进一步进行单细胞测序，以研究B细胞的基因表达和V(D)J重排情况。这种方法能够提高抗原经验B细胞的比例，从而增强后续分析的准确性。重组CHO技术和重组GS-NS0技术的应用使得单克隆抗体的产量大幅提高，从而支持了大规模生产的需求。

新型抗体药物双特异性抗体、三功能抗体等的研究正在快速发展。这些新型抗体药物在治疗领域展现出巨大的潜力，尤其是在肿瘤治疗和自身免疫性疾病治疗方面。

通过“knobs-into-holes”策略和免疫球蛋白域交叉技术，成功开发了多种双特异性IgG抗体。此外，研究还涉及了通过CD3亲和力调制生成的T细胞重定向双特异性抗体，以及针对肿瘤的4-1BB激动剂抗体-白蛋白融合物。这些研究为开发更有效的治疗策略提供了新的思路和方法。

通过使用knob-in-hole技术和交叉双变量免疫球蛋白G技术设计了三特异性抗体VRC01/PGDM1400-10E8v4和N6/PGDM1400-10E8v4，这些抗体展示了广谱中和活性，并在非人灵长类动物中提供了保护。然而，尽管这些双特异性和三特异性抗体增强了HIV-1的中和广谱性，但它们在增强亲和力方面的能力有限，这可能部分归因于HIV-1表面gp160三聚体的低密度。

人源化单抗技术已经在癌症治疗、自身免疫性疾病、病毒感染等领域展现出巨大的应用潜力。例如，在癌症治疗中，人源化单抗能够有效诱导ADCC（抗体依赖性细胞毒性）和CDC（补体依赖性细胞毒性）效应，提高治疗效果。此外，人源化单抗还被用于治疗自身免疫性疾病、病毒感染和风湿性疾病等。

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