肌酸激酶同工酶（CK-MB）-磁微粒化学法学发光（AE/AP） /荧光免疫层析解决方案
发布时间：2024-10-09 点击数：16
1.项目背景
CK-MB（肌酸激酶MB）是肌酸激酶（CK）的三个异构体（另两个是CK-BB和CK-MM）之一。CK是一种肌肉代谢的主酶，而这种肌肉代谢促成由三磷酸腺苷（ATP）产生的肌酐磷酸化的可逆反应。CK-MB由两个亚单位组成（MW=40000每个）：亚单位M表示肌肉，亚单位B表示大脑。
CK-MB同工酶主要存在于心肌中，占CK总活力的20%。在前列腺、脾或骨骼肌有超过5%的CK-MB量，而CK-MB的数量还会随肌肉类型的功能而变化。当发生急性心肌梗死（AMI）时，CK-MB即出现于血循环中并说明心肌层收到了损伤。CK-MB快速升高达到最高值（12小时内），之后会下降至正常水平（36-72小时）。CK-MB值的这种上升下降的变化形式，伴随ECG的演变和胸痛的病史，通常被认为是AMI的诊断。CK-MB的测定也有助于溶栓疗法下对心肌多次灌注液的效验而进行的非侵入性评估。同时，CK-MB水平的升高也和骨骼肌损伤有关，但在AMI中并无CK-MB水平的升高和下降。
免疫抑制技术最初用于测定CK-MB活性，并与CK总活力相比（比率CK-MB/CK）。但是，由于抗M抗体不能中和的CK-BB、腺苷酸环化酶（AK）和非典型CK（大CK）的存在，有时会导致CK-MB结果过高。
目前，许多测定CK-MB量（ng/mL）的酶免疫技术都与CK-MB活性测量密切相关，并且不受CK-BB、非典型CK和AK的干扰。
2.性能表现
针对CK-MB的检测，西宝生物推出2种单克隆抗体及1种抗原。具体性能如下
（以下评估仅代表在西宝生物的工艺体系下的验证，建议客户根据自身工艺进行抗体交叉配对验证）。
2.1化学发光（AE）平台：
组合1：肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）包被羧基磁珠+肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095K）标记吖啶酯；
线性范围：0.3ng/mL-300ng/mL；最低检出限：0.3ng/mL。
组合2：肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095K）包被羧基磁珠+肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）标记吖啶酯；
线性范围：0.3ng/mL-300ng/mL；最低检出限：0.3ng/mL。
2.2荧光免疫层析（镧系元素Eu螯合物填充）平台：
组合3：肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）标记荧光微球+肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095K）划膜；
线性范围：0.5ng/mL-100ng/mL；最低检出限：0.5ng/mL。
2.3化学发光（AP）平台：
组合4：肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095K）包被羧基磁珠+肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）标记碱性磷酸酶；
线性范围：0.3ng/mL-300ng/mL；最低检出限：0.3ng/mL。
浓度值在5000ng/mL以内没有发现高剂量钩状效应(HOOK效应)。
2.4 稳定性评估
2.4.1 碱性磷酸酶标记抗体稳定性
A）肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）标记碱性磷酸酶浓缩液采用AP酶标记物稀释液（货号：DCD0519A）稀释到合适浓度后，进行37℃热稳定性实验。如表1所示，CK-MB ALP酶工作液37℃储存热加速3天与2℃-8℃储存3天发光值平均降幅超过30%以上，表明CK-MB ALP酶工作液热稳定性差。
表1 CK-MB ALP酶工作液热稳定性3天数据（不含保护剂）
序号 | CK-MB校准品浓度ng/mL | CK-MB ALP酶工作液37℃储存热加速3天与2℃-8℃储存3天发光值均值差异 |
S0 | 0 | -1.58% |
S1 | 5 | -30.68% |
S2 | 25 | -28.41% |
S3 | 50 | -36.64% |
S4 | 150 | -31.84% |
S5 | 350 | -35.86% |
平均变化（不含S0） | -32.68% | |
B）在AP酶标记物稀释液（货号：DCD0519A）中添加5%左右的蛋白保护剂GH（货号：DCL0009A）配成新的AP酶稀释液，继续进行肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）标记碱性磷酸酶的37℃热稳定性实验。如表2所示，CK-MB ALP酶工作液37℃储存热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值平均降幅在10%左右，表明CK-MB ALP酶工作液热稳定性良好。本实验表明蛋白保护剂GH（货号：DCL0009A）对CK-MB ALP酶工作液的稳定性有很大帮助。
表2 CK-MB ALP酶工作液热稳定性7天数据（含保护剂）
序号 | CK-MB校准品浓度ng/mL | CK-MB ALP酶工作液（含蛋白保护剂GH）37℃储存热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值均值差异 |
S0 | 0 | 2.7% |
S1 | 5 | -8.5% |
S2 | 25 | -7.0% |
S3 | 50 | -10.4% |
S4 | 150 | -13.9% |
S5 | 350 | -4.8% |
平均变化（不含S0） | -8.9% | |
2.4.2 CK-MB抗原稳定性
A）采用CK-MB抗原稀释液（货号：DCD0520A）将CK-MB抗原（货号：EDD0408B）稀释成5个梯度（液体型），进行37℃热稳定性实验。如表3所示，CK-MB抗原稀释梯度（液体型）37℃热加速3天与2℃-8℃储存3天发光值平均降幅超过90%以上，表明CK-MB抗原稀释梯度（液体型）热稳定性非常差。
表3 CK-MB抗原稀释梯度（液体型）热稳定性3天数据
序号 | CK-MB校准品浓度ng/mL | CK-MB 抗原稀释梯度（液体型）37℃热加速3天与2℃-8℃储存3天发光值均值差异 |
S0 | 0 | 0.3% |
S1 | 5 | -89.3% |
S2 | 25 | -96.9% |
S3 | 50 | -97.9% |
S4 | 150 | -98.8% |
S5 | 350 | -99.1% |
平均变化（不含S0） | -96.4% | |
B）采用Seebio CK-MB抗原稀释液（货号：DCD0520A）将CK-MB抗原（货号：EDD0408B）稀释成5个梯度做冻干（冻干型），进行37℃热稳定性实验。如表4所示，CK-MB抗原稀释梯度（冻干型）37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值平均降幅在5%左右，表明CK-MB抗原稀释梯度（冻干型）热稳定性良好。
表4 CK-MB抗原稀释梯度（冻干型）热稳定性7天数据
序号 | CK-MB校准品浓度ng/mL | CK-MB 抗原稀释梯度 （冻干型）37℃热加速7天与2℃-8℃储存7天发光值均值差异 |
S0 | 0 | 1.1% |
S1 | 5 | -6.5% |
S2 | 25 | -2.3% |
S3 | 50 | -3.9% |
S4 | 150 | -2.8% |
S5 | 350 | -2.6% |
平均变化（不含S0） | -3.6% | |
3.临床相关性
3.1化学发光（AE）平台：
西宝生物发光（AE）平台CK-MB抗体配对组合1与罗氏CK-MB试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2>0.95，相关性良好；
西宝生物发光（AE）平台CK-MB抗体配对组合2与罗氏CK-MB试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2>0.95，相关性良好；
3.2荧光免疫层析平台：
西宝生物荧光平台CK-MB抗体配对组合3与罗氏CK-MB试剂（电化学发光法）赋值的的临床样本相关性R2>0.95，相关性良好；
3.3化学发光（AP）平台：
西宝生物发光（AP）平台CK-MB抗体配对组合4与罗氏CK-MB试剂（电化学发光法）赋值的临床样本相关性R2>0.95，相关性良好；
4.测试方案
4.1化学发光（AE）平台：
4.1.1抗体配对组合1
待测抗原:CK-MB抗原（货号：EDD0408B）,样本/标准品:加样量20ul；
试剂1：肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；
试剂2：肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095K）标记-吖啶酯稀释物，用量50ul/测试；
反应条件：
第一步：20ul样品+50ul试剂1+50ul试剂2混合，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入预激发液及激发液，进行测试。
4.1.2抗体配对组合2
待测抗原:CK-MB抗原（货号：EDD0408B）,样本/标准品:加样量20ul；
试剂1：肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095K）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；
试剂2：肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）标记-吖啶酯稀释物，用量50ul/测试；
反应条件：
第一步：20ul样品+50ul试剂1+50ul试剂2混合，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入预激发液及激发液，进行测试。
测试使用发光仪器:科斯迈SMART 500S。
4.2荧光免疫层析平台抗体配对组合3：
待测抗原:CK-MB抗原（货号：EDD0408B）,样本/标准品:加样量10ul；
反应条件：样本+荧光液混匀，上样，反应时间（10min-15min）；
测试使用荧光仪器:和迈FIC-S100。
4.3化学发光（AP）平台抗体配对组合4
待测抗原:PGII抗原（货号：）
样本/校准品:样品加样量20ul；
试剂1：肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095K）包被-磁珠稀释物，用量50ul/测试；
试剂2：肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）标记-碱性磷酸酶稀释物，用量50ul/测试；
反应条件：
第一步：10ul样品+50ul试剂1+50ul试剂2混合，37℃孵育10min，清洗；
第二步：加入底物，进行测试。
测试使用发光仪器:迎凯Shine i2900。
5.产品信息
产品名称 | 货号 | 推荐配对及其他信息 |
AP酶标记物稀释液 | DCD0519A | / |
蛋白保护剂GH | DCL0009A | 推荐使用浓度5%左右 |
CK-MB抗原稀释液 | DCD0520A | / |
肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体 | EKY0095J | 肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）包被羧基磁珠+肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095K）标记吖啶酯（发光配对组合1） 肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095K）包被羧基磁珠+肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）标记吖啶酯（发光配对组合2） 肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）标记荧光微球+肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095K）划膜（荧光配对组合3） 肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095K）包被羧基磁珠+肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体（货号：EKY0095J）标记碱性磷酸酶（发光配对组合4） |
肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体 | EKY0095K | |
肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗原 | EDD0408B | |
肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体 （货号：EKY0095J）-羧基磁珠浓缩液 | DKY1312A | |
肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体 （货号：EKY0095K）-吖啶酯浓缩液 | DKY1312B | |
肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体 （货号：EKY0095K）-羧基磁珠浓缩液 | DKY1312C | |
肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体 （货号：EKY0095J）-吖啶酯浓缩液 | DKY1312D | |
肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体 （货号：EKY0095J）标记荧光微球浓缩液 | DKY1312E | |
肌酸激酶同工酶（CK-MB）抗体 （货号：EKY0095J）-碱性磷酸酶浓缩液 | DKY1312F | |
羧基磁性微球，1.5um | DEG0800C | |
时间分辨荧光微球，羧基（200nm） | AEG0786B |
