PEG修饰剂在蛋白质和肽类药物中的应用
发布时间：2023-07-05 点击数：96
PEG可以与药物共价结合形成复合物，用于控制药物的释放，延长药物的半衰期，降低免疫原性和抗原性，降低毒性，增强药物靶向性，减少剂量和给药频率。PEGylation可以改善许多药物的药动学和药效学性质。
蛋白质类药物主要包括细胞因子、酶、抗体、激素等一些具有特殊功能的蛋白质。由于天然或重组的未经修饰的蛋白质类药物具有半衰期短、有一定的免疫原性、溶解度低、毒副作用大、易被蛋白酶降解等缺点，从而减弱了其临床效果。
目前，用于预防、治疗和诊断疾病的多肽类药物主要包括多肽疫苗、抗肿瘤多肽、抗病毒多肽、多肽导向药物、细胞因子模拟肽、抗菌性活性肽、诊断用多肽以及其他药用小肽等。
修饰机理
PEG修饰蛋白质和肽类药物可以延长药物的半衰期、降低免疫原性，同时尽量保留其生物活性。其机理为：蛋白质经过PEG化学修饰之后，修饰剂与蛋白质分子偶联，使得蛋白质的分子量增大，空间结构发生改变。PEG在被清除前不会被降解，PEG的屏障作用保护了蛋白质不易被蛋白酶降解，同时减少了抗体的产生，当修饰后的蛋白质分子量达到或超出肾小球滤过作用的闵值时，蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球滤过作用，因而可以在血液循环中停留更长的时间。
主要修饰位点
在构成蛋白质的20种常见氨基酸中，只有具有极性的氨基酸残基的側链基团才能够进行PEG修饰。其亲核活性通常按下列顺序依次递减：巯基>α-氨基>?-氨基>羧基>羟基。常用的氨基酸是蛋白质序列中的半胱氨酸、赖氨酸以及氮末端和碳末端氮基酸。
PEG和蛋白质或多肽之间的反应主要为酰化反应、烷基化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应等，对蛋白、肽类药物修饰途径主要有氨基修饰（包括N端氨基的酰化修饰、赖氨酸侧链氨基的酰化修饰、N端氨基的烷基化修饰）、羧基修饰、巯基修饰，还有其它如控制pH选择性修饰蛋白质侧链基团、金属离子或酶催化、糖蛋白中糖基定点修饰等。
1）氨基修饰
氨基修饰常用修饰剂为PEG-SS、PEG-SC、PEG-SPA、PEG-NHS、PEG-BTC、PEG-CHO、PEG-ALD、PEG-tresylate和PEG-epoxide等。
人类白细胞抗原（Human leucocyte antigen, HLA）是保持个体稳定的一组糖蛋白，在移植免疫中起着重要作用。为了研究mPEG 有效修饰HLA 抗原，阻断HLA 抗原与其相应抗体间特异性免疫反应的方法。随机挑选41例无偿血清10ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用HEPES/RPMI-1640 洗涤3次，调细胞浓度至每毫升2×105左右。在22℃，pH 7.4的PBS介质中，采用浓度梯度法用mPEG-BTC（MW 5kD）修饰淋巴细胞表面HLA-I类抗原。结果显示经mPEG-BTC取代后的淋巴细胞表面HLA-I类抗原与其相应抗体间的微量淋巴细胞毒试验为阴性。也就是经mPEG修饰后可以完全阻断HLA- I类抗原与其相应抗体间的特异性免疫反应[1]。
将奥曲肽与SPA-mPEG（MW 2000）或ALD-mPEG（MW 2000/5000）进行化学改性，通过生物活性检测发现，SPA-mPEG修饰的奥曲肽显示出较低的活性，而ALD-mPEG定点修饰在奥曲肽的N末端，生物活性没有降低且ALD-mPEG 5K能显著改善药代动力学特性[2]。
2）巯基修饰
蛋白质中和多肽中只有半胱氨酸含有巯基，利用巯基的高亲核性，可以选取能定向修饰蛋白质和多肽的PEG修饰剂。相对没有半胱氨酸的蛋白质，可以通过基因工程手段或是Traut’s试剂（2-亚氨氢氯化硫醇）处理蛋白引入巯基反应位点。常用修饰剂为PEG-Mal、PEG-OPSS、PEG-VS、PEG-IA、PEG-DAQ和PEG-Se等。
人睫状神经营养因子(human ciliary neuronotrophic factor,hCNTF)在中枢神经系统中可以促进神经干细胞的增殖，抑制其向胶质细胞的分化，具有保护受损神经元的功能。采用mPEG-MAL（MW 40kDa），对重组人睫状神经营养因子突变体CNTF-C17的第17位半胱氨酸巯基进行定点修饰。实验结果表明，在pH 8.0的Tris-HCl缓冲液体中，蛋白质与修饰剂的比例为1:3，4℃下反应12h，修饰率可达到90%以上，通过阴离子交换层析可获得纯度95%以上的单修饰产物。通过药代动力学考察，体内循环半衰期相对原蛋白显著提高了30.3倍[3]。
3）羧基修饰
羧基修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及末端羧基。首先需将羧基活化，即先将PEG中的羧基转化为氨基，再在DCCI或EDC存在下与蛋白质的羧基结合，常用的修饰剂为PEG-HZ或PEG-NH2[4]。
单链聚乙二醇只有末端可用于修饰新型偶联药物，因此载药量较低。后续不断开发出支链聚乙二醇，支链结构在一个或多个端上具有官能团，如末端呈树枝结构的支链PEG、叉状PEG和多臂PEG等，从而实现多种共轭可能性，且大大增加了载药量。
PEG修饰剂列表
|
货号
|
品名
|
描述
|
| ECS4133A | mPEG-NHS, MW 350 |
mPEG-Succinimidyl ester
 |
| AJL0190A | mPEG-SC, MW 1K | |
| ACS0112B | mPEG-SC, MW 2K | |
| ECS4382A | mPEG-SC, MW 3.4K | |
| AJL0190B | mPEG-SC, MW 5K | |
| ACS0115B | mPEG-SC, MW 10K | |
| ECS4219A | mPEG-SPA, MW 1K |
mPEG-Succinimidyl Propionate
 |
| ECS4356A | mPEG-SPA, MW 2K | |
| ECS4275A | mPEG-SPA, MW 5K | |
| ECS4094A | mPEG-SPA, MW 20K | |
| ECS4284A | mPEG-SS, MW 5K |
mPEG-Succinimidyl Succinate ester
 |
| ECS2001A | mPEG-SCM, MW 20K |
mPEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
 |
| ECS2103A | mPEG-SCM, MW 40K | |
| ECS4171A | mPEG-SG, MW 2K |
mPEG-Succinimidyl Glutarate ester
 |
| ECS4334A | mPEG-SVA, MW 5K |
mPEG-Succinimidyl valerate
 |
| ECS4154A | mPEG-Mal, MW 350 |
mPEG-Maleimide
 |
| ECS4155A | mPEG-Mal, MW 500 | |
| ECS4156A | mPEG-Mal, MW 1K | |
| DCS0133A | mPEG-Mal, MW 2K | |
| ECS4168A | mPEG-Mal, MW 4K | |
| ACS0135B | mPEG-Mal, MW 5K | |
| ACS0136A | mPEG-Mal, MW 10K | |
| ACS0137A | mPEG-Mal, MW 20K | |
| ECS4150A | mPEG-ALD, MW 1K |
mPEG-Aldehyde
 |
| ECS4194A | mPEG-CHO, MW 2K | |
| ACS0121A | mPEG-CHO, MW 5K | |
| ECS4212A | mPEG-EPO, MW 550 |
mPEG-Epoxide
 |
| ECS4198A | mPEG-EPO, MW 2K | |
| ECS4182A | mPEG-EPO, MW 10K | |
| ECS4317A | mPEG-HZ, MW 350 |
mPEG-Hydrazide
 |
| ECS4278A | mPEG-HZ, MW 2K | |
| ECS4157A | mPEG-NH2, MW 350 |
mPEG-Amine
 |
| ECS4244A | mPEG-NH2, MW 550 | |
| ECS2165A | mPEG-NH2, MW 1K | |
| ACS0105B | mPEG-NH2, MW 2K | |
| ACS0106B | mPEG-NH2, MW 3.4K | |
| ECS4296A | mPEG-NH2, MW 4K | |
| ACS0107B | mPEG-NH2, MW 5K | |
| ECS2180A | mPEG-NH2, MW 10K | |
| ACS0109B | mPEG-NH2, MW 20K | |
| ECS2069C | Mal-PEG-SCM, MW 2K |
Maleimide-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
 |
| ECS2069B | Mal-PEG-SCM, MW 5K | |
| ECS2069A | Mal-PEG-SCM, MW 10K | |
| ECS4208A | Mal-PEG-NHS, MW 200 |
Maleimide-PEG-NHS
 |
| ACS1695B | Mal-PEG-NHS, MW 2K | |
| ECS2072A | Mal-PEG-NHS, MW 3.4K | |
| ECS2065A | Mal-PEG-NHS, MW 5K | |
| ECS4137A | MAL-PEG-SVA, MW 5K |
Maleimide-PEG-Succinimidyl valerate
 |
| ECS4192A | Mal-PEG-HZ, MW 2K |
Maleimide-PEG-Hydrazide
 |
| ECS2005A | NHS-PEG-SH,MW 200 |
Thiol-PEG- Succinimidyl ester
 |
| ECS2006A | NHS-PEG-SH,MW 400 | |
| ECS2007A | NHS-PEG-SH,MW 500 | |
| ECS2017A | SH-PEG-NHS, MW 600 | |
| ECS2009A | NHS-PEG-SH,MW 800 | |
| ECS2010A | NHS-PEG-SH,MW 1K | |
| ECS4307A | SH-PEG-NHS, MW 2K | |
| ECS4407A | SH-PEG-NHS, MW 5K | |
| ECS4205A | SH-PEG-NH2, MW 600 |
Thiol-PEG-Amine
 |
| ECS4095A | SH-PEG-NH2, MW 2K | |
| ECS1978B | SH-PEG-NH2, MW 3.4K | |
| DCS2049A | SH-PEG-NH2, MW 5K | |
| ECS4142A | SH-PEG-NH2, MW 10K | |
| ECS2096A | SH-PEG-COOH, MW 400 |
Thiol-PEG-Acid
 |
| ECS4245A | SH-PEG-COOH, MW 1K | |
| ECS1991B | SH-PEG-COOH, MW 2K | |
| ECS2021A | SH-PEG-COOH, MW 3.4K | |
| ECS2118A | SH-PEG-COOH, MW 5K | |
| ECS2182A | SH-PEG-CHO, MW 5K |
Thiol-PEG- Aldehyde
 |
| ECS4174A | SH-PEG-SH, MW 400 |
Thiol-PEG-Thiol
 |
| ECS4173A | SH-PEG-SH, MW 600 | |
| ECS2084A | SH-PEG-SH, MW 2K | |
| ECS4143A | SH-PEG-HZ, MW 10K |
Thiol-PEG-Hydrazide
 |
| ECS4383A | SH-PEG-Biotin, MW 200 |
Thiol-PEG-Biotin
 |
| ECS4412A | SH-PEG-Biotin, MW 5K | |
| ECS4292A | SC-PEG-SC, MW 400 |
Succinimidyl ester-PEG-Succinimidyl ester
 |
| ECS2117B | SC-PEG-SC, MW 2K | |
| ECS4233A | SC-PEG-SC, MW 3.4K | |
| ECS4264A | SC-PEG-SC, MW 5K | |
| ECS4311A | SC-PEG-SC, MW 10K | |
| ECS4255A | NHS-PEG-COOH, MW 3.4K |
NHS-PEG-Acid
 |
| ECS2071A | NHS-PEG-VS, MW 3.4K |
NHS-PEG-Vinylsulfone
 |
| ECS4135A | NHS-PEG-OH, MW 2K |
NHS-PEG-Hydroxy
 |
| ECS4354A | SS-PEG-SS, MW 2K |
Succinimidyl Succinate ester-PEG-Succinimidyl Succinate ester
 |
| ECS4172A | SG-PEG-SG, MW 2K |
Succinimidyl Glutarate ester-PEG-Succinimidyl Glutarate ester
 |
| ECS4231A | SG-PEG-SG, MW 3.4K | |
| ECS2129A | SPA-PEG-SPA, MW 3.4K |
Succinimidyl Propionate-PEG-Succinimidyl Propionate
 |
| ECS4290A | SCM-PEG-SCM, MW 2K |
Succinimidyl Carboxymethyl Ester-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
 |
| ECS4195A | SCM-PEG-SCM, MW 5K | |
| ECS4291A | SCM-PEG-SCM, MW 20K | |
| ECS4298A | OPSS-PEG-NHS, MW 5K |
Ortho-Pyridyldisulfide-PEG-NHS
 |
| ECS4082A | OPSS-PEG-SCM, MW 5K |
Ortho-Pyridyldisulfide-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
 |
| ECS4199A | AC-PEG-SC, MW 2K |
Acrylate-PEG-NHS
 |
| ECS2051A | AC -PEG-SVA, MW 3.4K |
Acrylate-PEG-Succinimidyl valerate
 |
| ECS2098A | AC-PEG-SCM, MW 2K |
Acrylate-PEG-SCM
 |
| ECS4247A | Biotin-PEG-SCM, MW 600 |
Biotin-PEG-Succinimidyl Carboxymethyl Ester
 |
| ECS4343A | Biotin-PEG-SC, MW 2K |
Biotin-PEG- Succinimidyl ester
 |
| EYD0528B | Biotin-PEG-SC, MW 5K | |
| ECS4248A | Biotin-PEG-SS, MW 600 |
Biotin-PEG-Succinimidyl Succinate ester
 |
| ECS4249A | Biotin-PEG-SG, MW 600 |
Biotin-PEG-Succinimidyl Glutarate ester
 |
| ECS4246A | Biotin-PEG-SVA, MW 600 |
Biotin-PEG-Succinimidyl valerate
 |
| ECS4162A | CHO-PEG-OH, MW 2K |
Aldehyde-PEG-Hydroxy
 |
| ECS2174A | CHO-PEG-CHO, MW 2K |
Aldehyde-PEG-Aldehyde
 |
相关文献
[1]李 伟, 张印则, 周华友, 兰炯采, 章扬培, 张志欣. mPEG 修饰HLA 抗原的方法学研究. 生命科学研究, 2003, 7(4): 374-376.
[2] Dong Hee Na, Kang Choon Lee, Patrick P DeLuca. PEGylation of octreotide: II. Effect of N-terminal mono-PEGylation on biological activity and pharmacokinetics. Pharm Res, 2005, 22(5): 743-9.
[3]冯翠, 王祺, 张纯, 秦培勇, 郑秀玉, 王健, 刘永东, 苏志国. PEG定点修饰重组人睫状神经营养因子及其生物活性评价. 中国生物工程杂志, 2015, 35(5): 15-21.
[4] Kynclova E, Elsner E, K?pf A, et al. Novel method for coupling of poly(ethyleneglycol) to carboxylic acid moieties of proteins. Journal of Molecular Recognition, 1996, 9(5-6):644-651.
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